磷酸化多肽價(jià)格及磷酸化多肽操作步驟

操作步驟：

　　1.剪一適當(dāng)大小的硝酸纖維素膜并劃成25px大小的方格;

　　2.用(磷酸化多肽價(jià)格)緩沖液A浸濕膜并放于一用同樣緩沖液浸濕的濾紙上，使膜平坦;

　　3.用緩沖液B(含1mg/ml牛血清白蛋白)將樣品稀釋到合適的濃度，膜上每個(gè)點(diǎn)所加的樣品其激酶活性在0.5～50pmol單位(1pmol單位代表每分鐘轉(zhuǎn)移1pmol 32P的酶量)，當(dāng)酶比活性在1μmol/min·mg-1時(shí)則每個(gè)點(diǎn)應(yīng)加純酶0.5～50ng;

　　6.用(磷酸化多肽價(jià)格)緩沖液A 100ml洗膜4次，空氣干燥后進(jìn)行放射自顯影?；蚯谐煞綁K進(jìn)行液閃計(jì)數(shù)定量。

　　該方法在應(yīng)用時(shí)*常見(jiàn)的問(wèn)題是硝酸纖維素膜過(guò)載(指總蛋白或酶活力單位)。硝酸纖維素膜結(jié)合BSA的線性范圍可達(dá)50μg/cm2(相當(dāng)于每斑點(diǎn)5μg)，而結(jié)合容量可達(dá)500μg/cm2，如果樣品本身造成蛋白質(zhì)超載，則應(yīng)降低稀釋液中的BSA濃度。同時(shí)應(yīng)注意不要加過(guò)量的酶，因?yàn)槌^(guò)50pM單位即超過(guò)了該方法的線性范圍，并可能影響硝酸纖維素膜鄰近斑點(diǎn)的檢測(cè)。該方法用于其它蛋白激酶檢測(cè)時(shí)應(yīng)適當(dāng)變換測(cè)定條件。因蛋白激酶活性的斑點(diǎn)印跡方法與標(biāo)準(zhǔn)的液相方法在靈敏度、檢測(cè)范圍、線性等方面相當(dāng)，所以可以代替后者進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)。也在天然凝膠電泳和轉(zhuǎn)移電泳后分析蛋白激酶活性的分布，可用于分析酶在不同發(fā)育階段各組織表達(dá)的變化、cDNA克隆分析和突變體分析。

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